IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) ହେଉଛି β-galactosidase ସବଷ୍ଟ୍ରେଟର ଏକ ଆନାଲଗ୍, ଯାହା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଇନଡୁସିବଲ୍। IPTG ର ଇନଡୁସିବଲ୍ ଅଧୀନରେ, ଇନଡୁସିବଲ୍ ରିପ୍ରେସର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ଏକ ଜଟିଳ ଗଠନ କରିପାରିବ, ଯାହା ଦ୍ୱାରା ରିପ୍ରେସର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ର ରୂପାନ୍ତର ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୁଏ, ଯାହା ଫଳରେ ଏହାକୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଜିନ୍ ସହିତ ଯୋଡାଯାଇପାରିବ ନାହିଁ, ଏବଂ ଟାର୍ଗେଟ୍ ଜିନ୍ କୁ ଦକ୍ଷତାର ସହିତ ପ୍ରକାଶିତ ହୁଏ। ତେଣୁ ପରୀକ୍ଷଣ ସମୟରେ IPTG ର ସାନ୍ଦ୍ରତା କିପରି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯିବା ଉଚିତ? ଯେତେ ବଡ଼ ସେତେ ଭଲ କି?
ପ୍ରଥମେ, ଆସନ୍ତୁ IPTG ଇଣ୍ଡକ୍ସନର ନୀତିକୁ ବୁଝିବା: E. coli ର ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ଅପେରନ୍ (ମୌଳିକ) ରେ ତିନୋଟି ଗଠନମୂଳକ ଜିନ୍, Z, Y, ଏବଂ A ଅଛି, ଯାହା ଯଥାକ୍ରମେ β-galactosidase, permease, ଏବଂ acetyltransferase କୁ ଏନକୋଡ୍ କରିଥାଏ। lacZ ଲାକ୍ଟୋଜ୍ କୁ ଗ୍ଲୁକୋଜ୍ ଏବଂ ଗାଲାକ୍ଟୋଜ୍ କିମ୍ବା ଆଲୋ-ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ରେ ହାଇଡ୍ରୋଲାଇଜ୍ କରିଥାଏ; lacY ପରିବେଶରେ ଥିବା ଲାକ୍ଟୋଜ୍ କୁ କୋଷ ପରଦା ଦେଇ ଯିବାକୁ ଦେଇଥାଏ ଏବଂ କୋଷ ଭିତରକୁ ପ୍ରବେଶ କରିଥାଏ; lacA ଏସିଟେଲ୍ ଗୋଷ୍ଠୀକୁ ଏସିଟେଲ୍-CoA ରୁ β-galactoside କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରିଥାଏ, ଯାହା ବିଷାକ୍ତ ପ୍ରଭାବକୁ ଦୂର କରିଥାଏ। ଏହା ସହିତ, ଏକ କାର୍ଯ୍ୟକାରୀ କ୍ରମ O, ଏକ ଆରମ୍ଭ କ୍ରମ P ଏବଂ ଏକ ନିୟାମକ ଜିନ୍ I ଅଛି। I ଜିନ୍ କୋଡ୍ ଏକ ଦମନକାରୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଯାହା ଅପରେଟର୍ କ୍ରମର O ସ୍ଥିତି ସହିତ ବାନ୍ଧିପାରେ, ଯାହା ଫଳରେ ଅପେରନ୍ (ମେଟା) ଦମନ ଏବଂ ବନ୍ଦ ହୋଇଯାଏ। ଆରମ୍ଭ କ୍ରମ P ର ଅପଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ରେ କ୍ୟାଟାବୋଲିକ୍ ଜିନ୍ ଆକ୍ଟିଭେଟର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍-CAP ବନ୍ଧନ ସାଇଟ୍ ପାଇଁ ଏକ ବନ୍ଧନ ସାଇଟ୍ ମଧ୍ୟ ଅଛି। P କ୍ରମ, O କ୍ରମ ଏବଂ CAP ବନ୍ଧନ ସାଇଟ୍ ମିଳିତ ଭାବରେ ଲାକ୍ ଅପେରନ୍ ର ନିୟାମକ ଅଞ୍ଚଳ ଗଠନ କରନ୍ତି। ଜିନ୍ ଉତ୍ପାଦଗୁଡ଼ିକର ସମନ୍ୱିତ ପ୍ରକାଶନ ହାସଲ କରିବା ପାଇଁ ତିନୋଟି ଏନଜାଇମର କୋଡିଂ ଜିନ୍ ସମାନ ନିୟାମକ ଅଞ୍ଚଳ ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୁଏ।
ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ, ଲାକ୍ ଅପେରାନ୍ (ମେଟା) ଦମନ ଅବସ୍ଥାରେ ଥାଏ। ଏହି ସମୟରେ, PI ପ୍ରମୋଟର୍ କ୍ରମର ନିୟନ୍ତ୍ରଣରେ I କ୍ରମ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରକାଶିତ ଲାକ୍ ଦମନକାରୀ O କ୍ରମ ସହିତ ଯୋଡି ହୁଏ, ଯାହା RNA ପଲିମରେଜ୍ କୁ P କ୍ରମ ସହିତ ଯୋଡିବାରୁ ବାଧା ଦିଏ ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଆରମ୍ଭକୁ ବାଧା ଦିଏ; ଯେତେବେଳେ ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ଉପସ୍ଥିତ ଥାଏ, ଲାକ୍ ଅପେରାନ୍ (ମେଟା) ପ୍ରେରିତ ହୋଇପାରିବ ଏହି ଅପେରାନ୍ (ମେଟା) ସିଷ୍ଟମରେ, ପ୍ରକୃତ ପ୍ରେରକ ନିଜେ ଲାକ୍ଟୋଜ୍ ନୁହେଁ। ଲାକ୍ଟୋଜ୍ କୋଷରେ ପ୍ରବେଶ କରେ ଏବଂ β-galactosidase ଦ୍ୱାରା ଆଲୋଲାକ୍ଟୋଜରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହୁଏ। ପରବର୍ତ୍ତୀ, ଏକ ପ୍ରେରକ ଅଣୁ ଭାବରେ, ଦମନକାରୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସହିତ ଯୋଡି ହୁଏ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ରୂପାନ୍ତରଣକୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରେ, ଯାହା O କ୍ରମ ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ରୁ ଦମନକାରୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ର ବିଚ୍ଛିନ୍ନତାକୁ ନେଇଥାଏ। Isopropylthiogalactoside (IPTG) ର ଆଲୋଲାକ୍ଟୋଜ୍ ପରି ସମାନ ପ୍ରଭାବ ଥାଏ। ଏହା ଏକ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ପ୍ରେରକ, ଯାହା ଜୀବାଣୁ ଦ୍ୱାରା ମେଟାବୋଲିଜାଇଜ୍ ହୁଏ ନାହିଁ ଏବଂ ବହୁତ ସ୍ଥିର, ତେଣୁ ଏହାକୁ ପରୀକ୍ଷାଗାରରେ ବ୍ୟାପକ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ।
IPTG ର ସର୍ବୋତ୍ତମ ସାନ୍ଦ୍ରତା କିପରି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବେ? ଉଦାହରଣ ଭାବରେ E. coli ନିଆଯାଆନ୍ତୁ।
E. coli BL21 ଜେନେଟିକାଲ୍ ଇଞ୍ଜିନିୟର୍ଡ ଷ୍ଟ୍ରେନକୁ ଯୁକ୍ତାତ୍ମକ ପୁନଃସଂଯୋଜକ pGEX (CGRP/msCT) 50μg·mL-1 Amp ଧାରଣ କରିଥିବା LB ତରଳ ମାଧ୍ୟମରେ ଟୀକାକରଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ରାତାରାତି 37°C ତାପମାତ୍ରାରେ କଲଚର କରାଯାଇଥିଲା। ଉପରୋକ୍ତ କଲଚରକୁ ବିସ୍ତାର କଲଚର ପାଇଁ 1:100 ଅନୁପାତରେ 50μg·mL-1 Amp ଧାରଣ କରିଥିବା 50mL ତାଜା LB ତରଳ ମାଧ୍ୟମରେ 10 ବୋତଲରେ ଟୀକାକରଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଯେତେବେଳେ OD600 ମୂଲ୍ୟ 0.6~0.8 ଥିଲା, ସେତେବେଳେ IPTG ଚୂଡ଼ାନ୍ତ ସାନ୍ଦ୍ରତାରେ ଯୋଡା ଯାଇଥିଲା। ଏହା 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1। ସମାନ ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ ସମାନ ସମୟରେ ଇଣ୍ଡକ୍ସନ ପରେ, ଏଥିରୁ 1 mL ଜୀବାଣୁ ଦ୍ରବଣ ନିଆଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଜୀବାଣୁ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଗେସନ୍ ଦ୍ୱାରା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ଉପରେ ବିଭିନ୍ନ IPTG ସାନ୍ଦ୍ରତାର ପ୍ରଭାବ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ SDS-PAGE ର ଅଧୀନ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ତା'ପରେ ସର୍ବାଧିକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶନ ସହିତ IPTG ସାନ୍ଦ୍ରତା ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା।
ପରୀକ୍ଷଣ ପରେ, ଜଣାପଡିବ ଯେ IPTG ର ସାନ୍ଦ୍ରତା ଏତେ ବଡ଼ ନୁହେଁ। କାରଣ IPTG ର ଜୀବାଣୁ ପ୍ରତି ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବିଷାକ୍ତତା ଅଛି। ସାନ୍ଦ୍ରତା ଅତିକ୍ରମ କରିବା ଦ୍ଵାରା କୋଷ ମଧ୍ୟ ନଷ୍ଟ ହୋଇଯିବ; ଏବଂ ସାଧାରଣତଃ କହିବାକୁ ଗଲେ, ଆମେ ଆଶା କରୁଛୁ ଯେ କୋଷରେ ଯେତେ ଅଧିକ ଦ୍ରବୀର୍ଯ୍ୟଶୀଳ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶିତ ହେବ, ସେତେ ଭଲ, କିନ୍ତୁ ଅନେକ କ୍ଷେତ୍ରରେ ଯେତେବେଳେ IPTG ର ସାନ୍ଦ୍ରତା ଅତ୍ୟଧିକ ଅଧିକ ହେବ, ସେତେବେଳେ ଏକ ବଡ଼ ପରିମାଣର ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତି ଗଠନ ହେବ। ଶରୀର, କିନ୍ତୁ ଦ୍ରବୀର୍ଯ୍ୟଶୀଳ ପ୍ରୋଟିନର ପରିମାଣ ହ୍ରାସ ପାଇଛି। ତେଣୁ, ସବୁଠାରୁ ଉପଯୁକ୍ତ IPTG ସାନ୍ଦ୍ରତା ପ୍ରାୟତଃ ଯେତେ ବଡ଼ ହୁଏ ନାହିଁ, ବରଂ ସାନ୍ଦ୍ରତା ସେତେ କମ୍ ହୁଏ।
ଜେନେଟିକାଲି ଇଞ୍ଜିନିୟର୍ଡ ଷ୍ଟ୍ରେନର ଇନଡକ୍ସନ ଏବଂ ଚାଷର ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ହେଉଛି ଟାର୍ଗେଟ ପ୍ରୋଟିନର ଅମଳ ବୃଦ୍ଧି କରିବା ଏବଂ ଖର୍ଚ୍ଚ ହ୍ରାସ କରିବା। ଟାର୍ଗେଟ ଜିନର ପ୍ରକାଶନ କେବଳ ଷ୍ଟ୍ରେନର ନିଜସ୍ୱ କାରକ ଏବଂ ପ୍ରକାଶନ ପ୍ଲାଜମିଡ୍ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଭାବିତ ହୁଏ ନାହିଁ, ବରଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ବାହ୍ୟ ଅବସ୍ଥା, ଯେପରିକି ଇନଡକ୍ସନର ସାନ୍ଦ୍ରତା, ଇନଡକ୍ସନ ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ ଇନଡକ୍ସନ ସମୟ ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟ ପ୍ରଭାବିତ ହୁଏ। ତେଣୁ, ସାଧାରଣତଃ, ଏକ ଅଜଣା ପ୍ରୋଟିନ ପ୍ରକାଶିତ ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧ ହେବା ପୂର୍ବରୁ, ଉପଯୁକ୍ତ ପରିସ୍ଥିତି ଚୟନ କରିବା ଏବଂ ସର୍ବୋତ୍ତମ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଫଳାଫଳ ପାଇବା ପାଇଁ ଇନଡକ୍ସନ ସମୟ, ତାପମାତ୍ରା ଏବଂ IPTG ସାନ୍ଦ୍ରତା ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ସର୍ବୋତ୍ତମ।
ପୋଷ୍ଟ ସମୟ: ଡିସେମ୍ବର-୩୧-୨୦୨୧